Mở đầu

Sốt xuất huyết do virus (VHF - Viral haemorrhagic fevers) là một nhóm bệnh, từ các bệnh không nghiêm trọng như sốt Lassa, sốt thung lũng Rift, sốt vàng và sốt xuất huyết đến các bệnh đe dọa nghiêm trọng đến tính mạng như bệnh sốt do virus Ebola, sốt xuất huyết Marburg và sốt xuất huyết Crimean-Congo. VHF do nhiều loại virus RNA khác nhau thuộc các họ: Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Filoviridae và Rhabdoviridae gây ra, trong đó họ Filoviridae gây ra triệu chứng bệnh nặng với các biểu hiện cực đoan như tổn thương mạch máu toàn cơ thể dẫn đến xuất huyết lan rộng, suy đa tạng và tử vong.

Họ Filoviridae bao gồm 7 loài được chia thành 3 chi: Ebolavirus (5 loài), Marburgvirus (1 loài) và Cuevavirus (1 loài). Bốn loài trong số này: Zaire ebolavirus (ZEBOV), Sudan ebolavirus (SUDV), Bundibugyo ebolavirus (BDBV) và Marburg Marburgvirus (MARV) là tác nhân gây bệnh có triệu chứng tương tự nhau là sốt Ebola (EFD - Ebola fever disease) và sốt Marburg (MFD - Marburg fever disease) ở người.

Ngay khi có trường hợp nghi nhiễm filovirus (Ebola virus, Marburg virus), cần phải tiến hành các chẩn đoán bằng những xét nghiệm cơ bản, nhanh, nhạy và đặc hiệu trong PTN. Ngoài ra, các xét nghiệm loại trừ cũng được khuyến nghị thực hiện để tránh gây báo động giả và những rủi ro truyền thông tiềm tàng của việc chẩn đoán sai. Các chẩn đoán virus Ebola và Maburg hiện chủ yếu dựa trên việc phát hiện kháng nguyên virus hoặc RNA virus từ máu toàn phần, huyết thanh hoặc huyết tương. Do hai loại virus này là các tác nhân gây bệnh tối nguy hiểm với khả năng lây lan nhanh và tỷ lệ tử vong cao, các mẫu máu và mô nghi ngờ nhiễm trùng filovirus phải được xử lý trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3 hoặc 4 (BSL3, 4), đáp ứng được các điều kiện an toàn cho người thao tác cũng như tuyệt đối không phát tán mầm bệnh ra bên ngoài môi trường (Wagar, 2016).

Xuất phát từ thực tiễn cần thiết phải xây dựng một biện pháp cho phép phát hiện nhanh, chính xác và đặc hiệu với các tác nhân khủng bố sinh học Filovirus (virus Ebola và Marburg) để trang bị cho các PTN phản ứng nhanh với KBSH, Kỹ thuật real-time RT-PCR đã được lựa chọn để phát hiện đồng thời hai chi virus Ebola và Marburg trong cùng một phản ứng do đây là kỹ thuật có độ nhạy, độ chính xác cao nhất hiện nay để phát hiện các virus có vật liệu di truyền là RNA. Với kỹ thuật này, hiện tượng dương tính giả do nhiễm chéo sản phẩm nhân bội trong quá trình điện di cũng được loại bỏ. Một trong những ưu điểm khác của kỹ thuật real-time RT-PCR là khả năng “multiplex” với việc sử dụng các mẫu dò đánh dấu các chất phát huỳnh quang với dải phát xạ khác nhau.

Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã tiến hành thiết kế, sàng lọc và lựa chọn được tổ hợp mồi, mẫu dò real-time RT-PCR phát hiện đồng thời virus Ebola và Marburg, mẫu dò phát hiện virus Ebola được đánh dấu FAM, mẫu dò phát hiện virus Marburg sẽ được đánh dấu JOE và mẫu dò cho chứng nội sẽ được đánh dấu Texas Red. Tại nghiên cứu này chúng tôi tiếp tục tối ưu điều kiện real-time RT-PCR và đồng thời thử nghiệm xác định các đặc tính real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai chi virus Ebola và Marburg sử dụng tổ hợp mồi, mẫu dò đã lựa chọn. Nghiên cứu này là một phần công việc thuộc đề tài “Nghiên cứu chế tạo KIT Real-time RT-PCR phát hiện nhanh đồng thơi hai loại virus Ebola và Marburg phục vụ công tác phòng chống khủng bố” do Viện Khoa học và Công nghệ (H09) chủ trì thực hiện.

Nguyên liệu và phương pháp

Vật liệu, hóa chất

Mẫu RNA của các loại vi rút viêm gan B, vi rút viêm gan C, vi rút Dengue (DENV), vi rút viêm não Nhật Bản (JEV);

Plasmid gen tổng hợp đã giải trình tự đúng;

Các cặp mồi và mẫu dò tổng hợp;

Hệ vector: vector pMC051, pMC037 (addgene) dùng để tách dòng và biểu hiện gen;

Plasmid pJET1.2 chứa trình tự gen L đã tổng hợp nhân tạo của Ebola và Marburg.

Thiết bị

Các thiết bị sử dụng bao gồm: Tủ lạnh (0 - 40C) (Toshiba, Nhật); Tủ lạnh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, Mỹ); Tủ lạnh sâu -200C và -800C (Sanyo); Máy vortex (Rotolab, OSI); Máy spin down Sorvall Legend X1R (Thermo Fisher Scientific); Micropipette các loại Gilson (Pháp) và Biohit (Phần Lan); Hệ thống nhân gen Master Cycler RealPlex4 (Eppendorf).

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp RT-PCR một bước

Bảng 1.1. Họ Filoviridae và các bệnh tương ứng ở người (Bào. Y và cộng sự, 2017)

Sinh phẩm RT-qPCR được sử dụng là SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT- PCR Kit (Thermo Fisher Scientific). Thành phần phản ứng Multiplex RT-PCR được trình bày ở Bảng 2.1. Các phản ứng được thực hiện trên hệ thống MasterCycler RealPlex4 Eppendorf với chu trình nhiệt được thể hiện ở Bảng 2.2.

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR

Bảng 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex Real-time RT- PCR

Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Multiplex real-time RT-PCR đã được thực hiện bằng cách sử dụng RNA của virus Ebola và Marburg làm chứng dương cùng với các mẫu RNA của các loại vi rút viêm gan B, vi rút viêm gan C, vi rút Dengue (DENV), vi rút viêm não Nhật Bản (JEV) làm khuôn với số lần lặp thí nghiệm lặp lại là 10 lần.

Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Multiplex real-time RT-PCR đã được thực hiện bằng cách khuếch đại RNA tổng hợp của virus Ebola và Marburg với nồng độ các nồng độ khác nhau là: 2, 5, 10 và 20 phiên bản RNA/phản ứng.

Xác định khoảng định lượng của phản ứng multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Multiplex real-time RT-PCR đã được thực hiện bằng cách sử dụng khuôn là mẫu RNA của vi rút Ebola và Marburg với các nồng độ lần lượt là: 102, 103 , 104 và 105 phiên bản RNA/phản ứng. Mỗi nồng độ RNA được lặp lại 2 lần. Khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR được đánh giá dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa Log 10 của nồng độ RNA với giá trị Ct.

Kết quả và thảo luận

Xác định độ đặc hiệu của multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Mục đích của nghiên cứu này là xác định độ đặc hiệu của multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg. Để đạt được mục tiêu này, các phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR khuếch đại đã được thực hiện sử dụng RNA của các loại vi rút gây nhiễm trùng máu bao gồm: Vi rút viêm gan B (HBV), vi rút viêm gan C (HCV), vi rút Dengue (DENV), vi rút viêm não Nhật Bản (JEV). Phản ứng được thực hiện với số lần lặp lại là 3 lần.

Bảng 3.1. Kết quả xác định độ đặc hiệu của multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Kết quả cho thấy, phản ứng multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg chỉ cho kết quả dương tính với RNA của Ebola và Marburg và không cho kết quả dương tính với RNA của các loại vi rút khác. Số liệu trên cho thấy, phản ứng multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg chỉ phát hiệu đặc hiệu RNA của Ebola và Marburg và không có phản ứng chéo với các loại vi rút khác.

Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Mục đích của nghiên cứu này là xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR với MARV và EBOV. Để đạt được mục tiêu này, các phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR khuếch đại các lượng RNA khác nhau của của đoạn tổng hợp 1 (từ 2 đến 20 phiên bản RNA/phản ứng) đã được thực hiện.

Bảng 3.2. Kết quả chạy Multiplex Real-time RT-PCR ở các nồng độ 2, 5, 10, 20 phiên bản RNA/phản ứng phát hiện MARV

Bảng 3.3. Kết quả chạy Multiplex Real-time RT-PCR ở các nồng độ 2,5,10,20 phiên bản RNA/phản ứng phát hiện ZEBOV

Kết quả Multiplex Real-time RT-PCR nhằm xác định ngưỡng phát hiện MARV được thể hiện ở Bảng 3.2. Phân tích kết quả cho thấy ở nồng độ 2 phiên bản RNA/phản ứng, cho kết quả dương tính 5/6 lần lặp. Như vậy phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR được xây dựng có thể phát hiện MARV ngay ở ngưỡng 2 phiên bản/phản ứng. Các mẫu cho kết quả âm tính ở nồng độ này có thể là do xác suất không lấy được trong thể tích RNA đã hút. Nồng độ 5, 10 và 20 phiên bản/phản ứng cho kết quả dương tính ở cả 6 lần lặp. Như vậy, ngưỡng phát hiện của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR với MARV là 5 phiên bản RNA/phản ứng.

Xác định khoảng định lượng của multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Trong nội dung nghiên cứu này, khoảng định lượng được biểu diễn qua đường chuẩn mối quan hệ giữa giá trị Ct của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR và log 10 của nồng độ RNA phiên mã in vitro đã được khảo sát trong khoảng nồng độ RNA từ 102 đến 105 phiên bản/phản ứng.

Phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR được thiết lập để phát hiện đồng thời 2 loại vi rút. Kết quả trình bày ở Bảng 3.4 chỉ ra rằng cả hai đầu dò gắn nhãn FAM và HEX đều cho thấy tín hiệu huỳnh quang, hai mẫu EBOV và MARV đều được khuếch đại, cho phép phát hiện đồng thời 2 loại vi rút.

Bảng 3.4. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg

Hình 3.1. Độ tuyến tính của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR phát hiện MARV.

Hình 3.2. Độ tuyến tính của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR phát hiện EBOV.

Từ các giá trị Ct thu được (Bảng 3.4), đồ thị biểu diễn lên mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với nồng độ phiên bản RNA đích có trong các mẫu tương ứng được trình bày trong Hình 3.1 và Hình 3.2.

Từ kết quả đồ thị (Hình 3.1 và Hình 3.2) hệ số tương quan R2 khi phát hiện 2 loại vi rút đều đạt mức 0,99; hoàn toàn đáp ứng nhu cầu về khả năng định lượng. Khi phát hiện MARV, độ dốc của đồ thị đường chuẩn -3.53 tương đương với hiệu quả khuếch đại là E = 91,99%. Đối với phát hiện EBOV, độ dốc của đồ thị đường chuẩn là - 3.544, nên hiệu quả khuếch đại là E = 91,5%. Như vậy, phản ứng Multiplex Real- time RT-PCR có thể sử dụng để phát hiện đồng thời hai nhóm EBOV và MARV với khoảng định lượng từ 102 - 105 phiên bản/phản ứng.

Kết luận

Qua các thử nghiệm chúng tôi kết luận như sau:

Phản ứng multiplex real-time RT-PCR phát hiện đồng thời hai virus Ebola và Marburg chỉ phát hiệu đặc hiệu RNA của Ebola và Marburg và không có phản ứng chéo với các loại vi rút khác;

Ngưỡng phát hiện của phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR với Zaire ebolavirus là 10 phiên bản RNA/phản ứng, còn với Marburg là 5 phiên bản RNA/phản ứng;

Phản ứng Multiplex Real-time RT-PCR có thể được sử dụng để định lượng RNA của vi rút Ebola và vi rút Marburg trong khoảng nồng độ từ 100 đến 100000 phiên bản/phản ứng.

Tài liệu tham khảo

1. Bào Y, Amarasinghe GK, Basler CF, 2017. Implementation of Objective PASC-Derived Taxon Demarcation Criteria for Official Classification of Filoviruses. Viruses. 2017 May 11;9(5). pii: E106. doi: 10.3390/v9050106;

2. Barras, V., & Greub, G. (2014). History of biological warfare and bioterrorism. Clinical Microbiology and Infection, 20(6), 497-502. doi:10.1111/ 1469-0691.12706;

3. Broadhurst, M. J., Brooks, T. J. G., & Pollock, N. R. (2016). Diagnosis of Ebola Virus Disease: Past, Present, and Future. Clinical Microbiology Reviews, 29(4), 773-793. doi:10.1128/cmr.00003-16;

4. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Outbreaks Chronology: Ebola Virus Disease. tp://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/history/ chronology;

5. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Viral Haemorrhagic Fevers(VHFs). http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/filoviridae.html.

6. Emperador, D. M., Mazzola, L. T., Wonderly Trainor, B., Chua, A., & Kelly-Cirino, C. (2019). Diagnostics for filovirus detection: impact of recent outbreaks on the diagnostic landscape. BMJ Global Health, 4(Suppl 2), e001112. doi:10.1136/bmjgh-2018-001112;

7. Real-time PCR Handbook (Life Technologies);

8. Rougeron V, Feldmann H, Grard G, et al. Ebola and Marburg haemorrhagic fever. J Clin Virol 2015;64:111-9.

NGUYỄN THỊ THU HOÀI, VƯƠNG THANH HƯƠNG, TRẦN THỊ HẠNH

BÙI NGUYÊN HẢI, PHÙNG HUYỀN NHUNG, ĐINH BÁ TUẤN

Viện Khoa học và Công nghệ, Bộ Công an

Nguồn: Tạp chí Tài nguyên và Môi trường số 4 (Kỳ 2 tháng 2) năm 2023