Nghiên cứu khảo sát một số kháng thể phát hiện vi khuẩn bệnh than Bacillus anthracis

05/12/2023

TN&MTVi khuẩn Than Bacillus anthracis và một số loại vi khuẩn khác như Bacillus acereus, Bacillus thuringiensis cùng họ Bacillus nên có nhiều tương đồng về khả năng tạo bào tử và đặc điểm hình thái, di truyền. Do đó, một số kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử có cấu tạo tương tự nhau nên việc phát hiện bằng một số kháng thể sẽ có phản ứng chéo không đặc hiệu. 

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát một số kháng thể phát hiện bào tử và kháng thể phát hiện prrotein nội bào của Bacillus anthracis bằng thử nghiệm với các loại vi khuẩn cùng họ Bacillus như Bacillus acereus, Bacillus thuringiensis nhằm lựa chọn các kháng thể, kháng nguyên phù hợp sử dụng cho chế tạo que thử phát hiện đồng thời Bacillus anthracis và Yersinia pestis.

Mở đầu

Bệnh than với tác nhân là vi khuẩn Bacillus anthracis là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, nguyên nhân chính gây tử vong cho động vật trên toàn thế giới cho đến cuối thế kỷ 19. Đây là bệnh truyền nhiễm có ở động vật cỏ (dê, cừu, gia súc, ngựa) nhưng tất cả các loài động vật có vú bao gồm cả con người cũng đều dễ bị mắc bệnh [2]. Vi khuẩn Bacillus anthracis có hai plasmid là pXO1 và pXO2. Plasmid pXO1 (182 kb) chứa các gen mã hóa các thành phần của độc tố bệnh than gồm: yếu tố gây chết người (LF), yếu tố phù nề (EF) và kháng nguyên bảo vệ (PA). Plasmid pXO2 (96 kb) có tác dụng quan trọng giúp Bacillus anthracis trốn tránh khỏi hệ miễn dịch của vật chủ bằng cách chống lại hiện tượng thực bào của vật chủ [8].

Bacillus anthracis nằm ở vị trí cao trong danh sách các tác nhân tiềm năng liên quan đến chiến tranh sinh học và khủng bố sinh học, đã từng được sử dụng ở Hoa Kỳ vào năm 2001, các bào tử vi khuẩn dạng bột đã khiến cho 43 người bị mắc bệnh và có 5 ca tử vong trong số 22 ca nhiễm bệnh có triệu chứng bệnh nặng [4].

Thể giới đã phát triển một số sản phẩm như hệ thống PCR cầm tay hoặc các sinh phẩm dạng sắc ký miễn dịch có thể phát hiện được B. anthracis tại hiện trường [1] [5].

Trong bối cảnh hiện tại ở Việt Nam, việc phát hiện các tác nhân khủng bố là một trong những nhiệm vụ rất quan trọng, góp phần phục vụ công tác bảo vệ anh ninh, chiến đấu của lực lượng Công an nhân dân.

Trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu thực hiện nghiên cứu khảo sát một số kháng thể phát hiện Bacillus anthracis, kết quả nghiên cứu phục vụ đáp ứng mục tiêu đề tài: “Nghiên cứu chế tạo Bộ sinh phẩm phát hiện nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn tối nguy hiểm Bacillus anthracis và Yersinia pestis” do Viện Khoa học và Công nghệ (H09) thực hiện.

Nguyên liệu và phương pháp

Nguyên liệu: Kháng thể kháng B. anthracis: 

Kháng thể đơn dòng 8G4 kháng bào tử B. anthracis (Tetracore);

Kháng thê đơn dòng 10C-CR9004M1 kháng kháng nguyên PA (Fitzgerald);

Kháng thể đơn dòng 10C-CR9004M2 kháng kháng nguyên PA (Fitzgerald);

Kháng thể đa dòng kháng bào tử B. anthracis 

Kháng thể đa dòng 70-1007 kháng kháng nguyên PA (Fitzgerald);

Kháng thể đa dòng M5899 kháng IgG chuột (Sigma);

Các loại hóa chất, màng nitrocellose, thiết bị sử dụng cho chế tạo que thử sắc ký miễn dịch, máy phun trải gắn kháng thể LINOMAT 5 (CAMAG), máy cắt que AUTOKUN Cutter .

Phương pháp: Tạo bào tử (đối với B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis): Vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh và sử dụng một số môi trường đặc hiệu để vi khuẩn hình thành bào tử [3].

Tinh sạch bào tử: Loại bỏ các tế bào sinh dưỡng và các hóa chất, môi trường. Rửa bào tử và hòa tan lại bằng nước tinh khiết để sử dụng cho nghiên cứu [6].

Cộng hợp vàng: Sử dụng bộ KIT cộng hợp để tạo cộng hợp phát hiện là các kháng thể kháng B. anthracis đã đề cập phần nguyên liệu. Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cộng hợp bi vàng-kháng thể bảo quản ở 2-8oC.

Phun gắn kháng thể lên màng: Tạo vạch TL (Testline): Kháng thể đa dòng kháng bào tử B. anthracis hoặc kháng thể đa dòng mã hiệu 70-1007 được phun lên màng với nồng độ 1,5 µg/cm; tạo vạch CL (Controline): Kháng thể đa dòng M5899 được phun lên màng với nồng độ 1 µg/cm.

Sau đó màng được sấy 37oC trong 1 giờ và cắt thành que thử có độ rộng 4-5 mm.

Chạy que thử: Chuẩn bị mẫu bào tử với các nồng độ 105; 106; 107; 108; 109 bào tử/que thử. Bổ sung bi thủy tinh và đặt trong bể siêu âm trong 2 phút. Chuẩn bị 100 µl dịch mẫu sau siêu âm, bổ sung 2 µl kháng thể cộng hợp bi vàng, trộn đều và cắm que thử vào mẫu. Đọc kết quả sau 20-25 phút.

Kết quả và thảo luận

Kết quả kiểm tra kháng thể của hãng Tetracore (8G4): 8G4 là kháng thể kháng bào tử B. anthracis đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước. Kết quả thử nghiệm ở Hình 1 cho thấy ở nồng độ 106 bào tử/que, vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng xuất hiện rõ ràng. Trong khi mẫu kiểm chứng âm chỉ xuất hiện vạch kiểm chứng.

Với các nồng độ 107 - 109 bào tử/que, hầu như không quan sát được cả hai vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng. Bên cạnh đó, xuất hiện các vết đậm ở vùng mẫu và cường độ các vệt này tăng dần cùng với lượng bào tử được sử dụng. Kết quả này có thể được giải thích bởi hiện tượng tạo phức hợp kháng thể - bi vàng với bào tử. Ở nồng độ cao, bào tử sẽ phản ứng tăng cường với phức hợp kháng thể - bi vàng tạo thành một mạng lưới có cấu trúc không gian lớn khiến chúng không thể di chuyển trên màng nitrocellulose. Do vậy, kháng thể 8G4 không phù hợp để sử dụng chế tạo que thử vì không phát hiện được mẫu ở nồng độ trên 107 bào tử/que.

Kết quả kiểm tra kháng thể của hãng Fitzgerald

Hai cấu hình phát hiện kháng nguyên PA để tránh hiện tượng tụ bi đều sử dụng cùng một loại kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên PA có mã hiệu 70-1007 sản xuất bởi Fitzgerald để phun lên màng nitrocellulose tao vạch thử nghiệm T và hai loại kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên PA có mã hiệu lần lượt là 10C-CR9004M1 và 10C-CR9004M2 để tạo cộng hợp kháng thể - bi vàng để liên kết đặc hiệu với kháng nguyên PA. Tuy nhiên, kháng nguyên PA là protein nội bào nên cần phá vỡ vỏ bào tử để chiết xuất được kháng nguyên. Phương pháp chuẩn bị mẫu được sử dụng trong nghiên cứu này là siêu âm với sự có mặt của bi thủy tinh để thu dịch chiết bào tử.

Kết quả thử nghiệm hai cấu hình que thử sử dụng các kháng thể từ Fitzgerald để phát hiện kháng nguyên PA đặc hiệu B. anthracis cho thấy: 

Tất cả các que thử đều cho vạch kiểm chứng rõ nét. Que thử chạy với mẫu chứng âm không xuất hiện tín hiệu tại vạch thử nghiệm. Điều này chứng tỏ các que thử không có hiện tượng dương tính giả.

Các mẫu que thử ở cả hai cấu hình khi chạy với dịch chiết bào tử có nồng độ tương đương từ 106 - 108 bào tử/que cho vạch thử nghiệm có tín hiệu rõ ràng và có thể xác định bằng mắt thường.

Que thử chạy với dịch chiết bào tử B. anthracis nồng độ tương đương 105 bào tử/que có xuất hiện vạch tín hiệu mờ.

Kết quả phân tích tín hiệu bằng phần mềm ImageJ cho thấy các que thử của cấu hình I (sử dụng kháng thể đơn dòng 10C-CR9004M1 làm kháng thể công hợp) khi chạy với nồng độ dịch chiết bào tử tương đương 107- 108 bào tử/que cho kết quả vạch thử nghiệm rõ nét hơn so với các que thử ở cấu hình II (sử dụng kháng thể đơn dòng 10C-CR9004M2 làm kháng thể công hợp bi vàng) ở tất cả các nồng độ bào tử đã khảo sát.

Từ kết quả trên cho thấy, các kháng thể Fitzgerald để phát hiện kháng nguyên PA có thể phát hiện được bào tử B. anthracis. que thử sử dụng kháng thể đơn dòng 10C-CR9004M1 làm kháng thể công hợp ở cấu hình I cho kết quả phát hiện tốt hơn so với các que thử ở cấu hình II (sử dụng kháng thể đơn dòng 10C-CR9004M2 làm kháng thể công hợp bi vàng). Vì vậy, cấu hình que thử I sẽ được lựa chọn để phát hiện B. anthracis trong các nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả kiểm tra với vi khuẩn Bacillus cereus: Kết quả xác định khả năng que thử phát hiện B. anthracis đối với dịch chiết bào tử và dịch chiết tế bào sinh dưỡng của B. cereus:

Tất cả các que thử được dùng cho thử nghiệm đều cho vạch kiểm chứng rõ nét. Que thử chạy với mẫu chứng âm không hiện vạch thử nghiệm, que thử chạy với dịch chiết bào tử B. anthracis (tương đương 106 bào tử/que) xuất hiện vạch thử nghiệm rõ ràng. Điều này chứng tỏ các que thử đều hoạt động bình thường. 

Que thử chạy với dịch chiết bào tử B. cereus tương đương 108 bào tử/que và que thử chạy với dịch chiết tế bào sinh dưỡng B. cereus tương đương 108 CFU/que đều không xuất hiện vạch thử nghiệm. Cường độ tín hiệu ở vị trí vạch thử nghiệm thu được ở hai que thử này không có khác biệt quá lớn so với mẫu chứng âm (lần lượt là 145 và 282 so với 245 AU). Điều này cho thấy các que thử chạy trên dịch chiết bào tử và dịch chiết tế bào sinh dưỡng của B. cereus đều cho kết quả âm tính.

Từ các kết quả trên, có thể thấy rằng que thử phát hiện B. anthracis không xảy ra phản ứng chéo với dịch chiết bào tử và dịch chiết tế bào sinh dưỡng của B. cereus.

Kết quả kiểm tra với Bacillus thuringiensis: Để đánh giá khả năng phản ứng chéo của que thử nhanh phát hiện B. anthracis, chúng tôi thử nghiệm với dịch chiết bào tử và dịch chiết tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Kết quả cho thấy:

Tất cả các que thử được dùng cho thử nghiệm đều cho vạch kiểm chứng rõ nét. Que thử chạy với mẫu chứng âm không hiện vạch thử nghiệm, que thử chạy với dịch chiết bào tử B. anthracis (tương đương 106 bào tử/que) xuất hiện vạch thử nghiệm rõ ràng. Điều này chứng tỏ các que thử đều hoạt động bình thường. 

Que thử chạy với dịch chiết bào tử B. thuringiensis tương đương 108 bào tử/que và que thử chạy với dịch chiết tế bào sinh dưỡng B. thuringiensis tương đương 108 CFU/que đều không xuất hiện vạch thử nghiệm. Cường độ tín hiệu ở vị trí vạch thử nghiệm thu được ở hai que thử này không có khác biệt quá lớn so với mẫu chứng âm. Điều này cho thấy các que thử chạy trên dịch chiết bào tử và dịch chiết tế bào sinh dưỡng của B. thuringiensis đều cho kết quả âm tính.

Từ kết quả thử nghiệm thu được, que thử phát hiện B. anthracis không phản ứng với vi khuẩn Bacillus thuringiensis.

Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu thử nghiệm lựa chọn kháng thể phù hợp cho mục đích chế tạo que thử kép, chúng tôi kết luận như sau:

Kháng thể phát hiện trực tiếp bào tử Bacillus anthracis mã hiệu 8G4 của hãng Tetracore có thể phát hiện được bào tử vi khuẩn ở nồng độ thấp. Khi ở nồng độ bào tử cao, xảy ra hiện tượng tụ bi làm que thử không có tác dụng.

Kháng thể được lựa chọn phù hợp nhất cho chế tạo qu thử là kháng thể đơn dòng mã hiệu 10C-CR9004M1 của hãng Fitzgerald phát hiện kháng nguyên PA (protein nội bào của bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis) Bào tử vi khuẩn cần xử lý phá vỏ bào tử để giải phóng nguyên PA.

Kháng thể 10C-CR9004M1 được thử nghiệm đối với bào tử và tế bào sinh dưỡng của hai loại vi khuẩn cùng họ Bacillus là Bacillus cereus và Bacillus thrringiensis không có phản ứng chéo với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm. Điều đó cho thấy Kháng thể 10C-CR9004M1 chỉ đặc hiệu đối với vi khuẩn Than.

Tài liệu tham khảo

1.    A. A. Zasada, “Detection and Identification of Bacillus anthracis: From Conventional to Molecular Microbiology Methods,” Microorganisms, vol. 8, no. 1, Jan. 2020, doi: 10.3390/MICROORGANISMS8010125;

2. “Anthrax outbreaks: a warning for heightened awareness.” https://www.fao.org/publications/card/en/ c/bdce4fbb-8f8b-401e-96a5-86a5338a678a/ (accessed Aug. 31, 2022);

3. D. B. Wang et al., “Detection of Bacillus anthracis spores by super-paramagnetic lateral-flow immunoassays based on ‘Road Closure’” Biosens. Bioelectron., vol. 67, pp. 608-614, May 2015, doi: 10.1016/J.BIOS.2014.09.067;

4. “History of Anthrax | CDC.” https://www.cdc.gov/ anthrax/basics/anthrax-history.html (accessed Aug. 31, 2022);

5. I. Ziegler, P. Vollmar, M. Kn#pfer, P. Braun, and K. Stoecker, “Reevaluating limits of detection of 12 lateral flow immunoassays for the detection of Yersinia pestis, Francisella tularensis, and Bacillus anthracis spores using viable risk group-3 strains,” J. Appl. Microbiol., vol. 130, no. 4, pp. 1173–1180, Apr. 2021, doi: 10.1111/JAM.14863;

6. M. Weldy, C. Evert, P. I. Dosa, A. Khoruts, and M. J. Sadowsky, “Convenient Protocol for Production and Purification of Clostridioides difficile Spores for Germination Studies,” STAR Protoc., vol. 1, no. 2, p. 100071, Sep. 2020, doi: 10.1016/J.XPRO.2020.100071;

8. R. C. Spencer, “Bacillus anthracis,” J. Clin. Pathol., vol. 56, no. 3, p. 182, Mar. 2003, doi: 10.1136/JCP.56.3.182.

BÙI NGUYÊN HẢI, NGUYỄN THỊ NGA, TRẦN TRỌNG HỘI, NGYỄN THỊ THU HOÀI, TRẦN THỊ HẠNH

Viện Khoa học và công nghệ, Bộ Công an

Nguồn: Tạp chí Tài nguyên và Môi trường số 5 (Kỳ 1 tháng 3) năm 2023
 

Tin tức

Hướng về Điện Biên nhân dịp kỷ niệm 70 năm Chiến thắng Điện Biên Phủ

Dự kiến Ban hành Quy chuẩn Việt Nam về khí thải ô tô đang lưu hành và lộ trình áp dụng trong Quý I/2024

Người dân phải được hưởng những thành tựu mới nhất của ngành dược

Thống nhất đầu mối quản lý trong lĩnh vực địa chất, khoáng sản

Tài nguyên

Luật Đất đai (sửa đổi): Bệ đỡ cho thị trường bất động sản bứt phá

Kiên quyết xử lý hành vi vi phạm về khai thác khoáng sản và môi trường 

Bộ Tài nguyên lấy ý kiến dự thảo Nghị định tính giá đất theo 4 phương pháp

Nguồn cung bất động sản Hà Nội sẽ được cải thiện trong năm 2024

Môi trường

Quảng Ngãi phạt 330 triệu đồng doanh nghiệp xả nước thải có chứa xyanua vượt ngưỡng ra môi trường

Nhiều tuyến suối tại TP Thủ Đức ô nhiễm nặng

Một doanh nghiệp xả thải có thông số Xyanua vượt quy chuẩn hơn 20 lần

Giải cứu những dòng sông ô nhiễm

Video

Kỷ niệm 20 năm Tạp chí Tài nguyên và Môi trường và ra mắt kỷ ra mắt chuyên trang tiếng Anh

Tình yêu Môi trường

Thế giới lo sợ vì biến đổi khí hậu đã “Ngoài tầm kiểm soát” và kêu gọi hành động toàn cầu

Dự án Luật địa chất và khoáng sản sửa đổi khắc phục hạn chế để phát huy nguồn lực khoáng sản

Khoa học

Giải mã tên một dòng sông

Đoàn kết vì hệ thống lương thực bền vững

Hành trình "gọi tên tổn thương" bằng AI của Phó Giáo sư trẻ

Màng chuyển đổi CO2 thành chất hữu dụng

Chính sách

Áp quy định mới, doanh nghiệp bất động sản hết cửa 'tay không bắt giặc'

Quy định mới về thu phí khai thác sử dụng tài liệu địa chất, khoáng sản

Thực hiện chính sách 'giải nén', giảm tải cho các đô thị lớn

Loạt dự án biệt thự du lịch, sân golf ở Ninh Bình vi phạm về đất đai, xây dựng

Phát triển

Bến Tre: Tăng trưởng kinh tế, chú trọng bảo vệ môi trường

Tinh thần “đi trước mở đường”

Đầu năm, loạt địa phương tìm nhà đầu tư cho nhiều dự án lớn

Đà Nẵng xây dựng Công viên Rồng tại quận Sơn Trà

Diễn dàn

Đẩy nhanh tiến độ các dự án giao thông trọng điểm: Tạo nền tảng cho sự tăng trưởng

Nhiều khu vực tại huyện Trần Văn Thời (Cà Mau) bị sụt lún

Thời tiết ngày 20/2: Miền Bắc vẫn sương mù, trưa có nơi nắng nóng

Thời tiết ngày 19/2: Miền Bắc gia tăng nắng trước khi đón không khí lạnh