Ở điều kiện nuôi cấy 0,5% muối trong 48 giờ, chủng BC3 đạt lượng exopolysaccharide cao nhất 11,25 g/L, BC1, BC2 lần lượt là 4,5 g/L và 5,0 g/L. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ 350C trong 48 giờ, cả 3 dòng vi khuẩn Bacillus sp. BC1, BC2 và BC3 sinh lượng exopolysaccharide tối ưu nhất lần lượt là 9,05 g/L, 4,45 g/L và 5,45 g/L. Khi muối cao 1% và nhiệt độ 600C thì hàm lượng EPS được tạo ra rất thấp cho thấy nồng độ muối, nhiệt độ ủ và thời gian đều ảnh hưởng đến khả năng sản xuất sinh khối và EPS ở chủng vi khuẩn Bacillus sp.

Từ khóa: Vi khuẩn Bacillus sp., Exopolysaccharide (EPS).

Giới thiệu

Exopolysaccharides (EPS) được liên kết bởi các đường đơn chủ yếu là glucose, galactose và rhamnose. EPS có độ nhớt cao được vi khuẩn tách khỏi tế bào và tiết vào môi trường nuôi cấy hay EPS có thể bám vào tế bào và tạo thành một lớp gắn chặt bao quanh tế bào. EPS có chức năng bảo vệ tế bào khỏi bị tác động bởi các điều kiện môi trường bất lợi và các điều kiện môi trường gây sốc (stress); duy trì áp suất thẩm thấu, hút ẩm, tập trung chất dinh dưỡng, thực bào, tấn công thể thực khuẩn, kháng sinh hoặc giảm tiếp xúc với các chất độc hại, tăng khả năng bám dính bề mặt, tăng khả năng bảo vệ và sống sót của vi sinh vật trong các điều kiện môi trường không thuận lợi. EPS được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp chế biến sữa, thực phẩm tạo nên kết cấu, cảm giác ngon miệng, cảm nhận về mùi vị và tính ổn định của sản phẩm cuối cùng (Kondo & Iida, 1997). EPS tự nhiên có khả năng chữa bệnh, trị liệu, tăng cường sức khỏe, kháng khuẩn, chống ung thư, chống viêm, điều hòa miễn dịch, probiotic mỹ phẩm, xử lý sinh học, các polysaccharide được xem là chất thay thế cho thuốc tổng hợp (Angelin & Kavitha, 2020). Đặc biệt, EPS, nhựa sinh học, có thể giúp thay thể rác thải nhựa có nguồn gốc hóa dầu (Zaki, 2018). EPS có thể được sản xuất từ nhiều nguồn như thực vật, tảo và vi khuẩn. Chẳng hạn, trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng hoặc stress, vi khuẩn Bacillus sp. tích tụ EPS nhất là trong giai đoạn cuối của chu kỳ tăng trưởng (Asgher et al., 2020; McKenney et al., 2013). Tuy nhiên, tác động của nhiệt độ và độ mặn đến việc tăng sinh EPS đối với vi khuẩn này cần được nghiên cứu nhiều hơn để tối ưu hóa sản xuất EPS. 

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Vật liệu và mẫu 

Nghiên cứu này sử dụng acid trichloroacetic, H2O2 30%, Crystal Violet, Lugol, Saframin, cồn 70o, 96o, nước cất, safranin O 2,5%, môi trường TSA (Tryptone Soya Agar), LB broth (Luria Bertani Broth); tủ cấy an toàn sinh học (Singapore) và đĩa petri. 

Vi khuẩn Bacillus sp. được phân lập và định danh từ đất nông nghiệp tại xã Thạnh Quới, huyện Vĩnh Thạnh, TP. Cần Thơ được nuôi cấy trên đĩa petri ở 370C, môi trường TSA (Tryptone Soya Agar), thanh trùng ở 1210C, 15 phút, sau đó, được tăng sinh giống cấp 1, cấp 2 để làm nguồn giống chủng cho nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu

Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối và thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp EPS.

Dùng bình tam giác 2 L chứa 1,5 L môi trường LB lỏng, bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,25%, 0,5%, 1% thanh trùng ở 1210C, 15 phút và để nguội ở nhiệt độ phòng. Hút 20 mL nguồn giống cấp 2 cho vào bình môi trường, tăng sinh trong 24 h, 48 h, 72 h ở nhiệt độ phòng.

Từ 200 mL dịch nuôi cấy tiến hành tủa protein và peptide bởi acid trichloroacetic 30% (TCA). Rửa kết tủa hai lần để thu được EPS tốt. Dịch nổi thu được sau khi ly tâm được rửa bởi ethanol lạnh lần 1 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol là 1: 3). Hòa tan tủa trong nước cất 50oC (khoảng 2 mL). EPS trong dịch nổi thu được sau khi ly tâm được kết tủa bởi ethanol lạnh lần 2 (tỷ lệ dịch nổi: ethanol là 1: 3). Kết tủa được thu nhận, sấy đông khô xác định khối lượng. 

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp EPS.

Ghi nhận khả năng tăng trưởng sinh khối của vi khuẩn Bacillus sp và thu nhận exopolysaccharide được bố trí ở 3 mức nhiệt độ 350C, 450C, 600C trong khoảng thời gian 24 h, 48 h, 72 h. 

Phân tích dữ liệu

Xử lí thống kê mô tả bằng phần mềm Excel và Statgraphics và các số liệu biểu diễn giá trị trung bình của 3 lần lặp lại ± độ lệch chuẩn với mức ý nghĩa p < 5%.

Kết quả thảo luận

Ảnh hưởng của nồng độ muối và thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp EPS

Cả 3 dòng vi khuẩn Bacillus sp. đều có khả năng tạo exopolysaccharide dưới điều kiện ảnh hưởng của nồng độ muối và nhiệt độ, kết quả được thể hiện ở Bảng 1: 

Bảng 1: Nồng độ muối, thời gian ủ và EPS của vi khuẩn Bacillus sp. BC1, BC2, BC3

Ghi chú: 3 lần lặp lại, ± độ lệch chuẩn với mức ý nghĩa p < 5%.

Kết quả cho thấy, ở nồng độ muối 0,25% cả 3 dòng vi khuẩn đều sinh tổng hợp EPS trung bình đạt khoảng 3,4 g/L với thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (Bảng 1), điều này tương tự như nghiên cứu của Asgher & cs (2020) đối với các dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis dưới điều kiện nuôi cấy thông thường tạo khoảng 3.4 g/L. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, khi tăng nồng độ muối NaCl tăng từ 0,25% lên 0,5 % thì lượng EPS đều tăng ở tất cả các 3 dòng, nhất là BC3 có EPS cao nhất 11,25g/L sau 48 giờ nuôi cấy trong khi BC1, BC2 lần lượt là 4,5 g/L và 5 g/L. Nếu kéo dài thời gian nghiên cứu đến 72 giờ thì lượng EPS giảm dần lần lượt là 9,5 g/l, 4,2g/L và 3,9 g/L đối với BC3, BC1, BC2. Khi cùng nồng độ muối 0,5% thì việc kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm khả năng chịu đựng của vi khuẩn kéo theo sinh khối vi khuẩn và EPS giảm. Khi nồng độ muối NaCl tăng lên 1% thì gây ức chế sự phát triển vi khuẩn và dẫn đến lượng EPS giảm theo lần lượt là 2,35g/L, 2,05g/L và 1,95 g/L đối vưới BC3, BC1, BC2 sau 48 giờ nuôi cấy. Lý dó là khi nồng độ muối cao thì vi khuẩn Bacillus sp. duy trì sự sống bằng cách tạo ra một lượng lớn bào tử (Yeniel et al., 2006) nhưng việc này lại hạn chế quá trình tích tụ EPS (McKenney et al., 2013). Khi nồng độ muối NaCl tăng từ 0,25% lên 1% thì lượng EPS giảm từ 3,4 g/L xuống còn 2,04 g/L, trong khi ở nồng độ 0,5% thì lượng EPS đạt tối ưu trung bình đạt 5,01 g/L. Kết quả cho thấy nồng độ muối NaCl 0,5% đã gây sốc vi khuẩn và cơ chế tạo EPS như màng bảo vệ tế bào đạt cao nhất, nhưng nồng độ NaCl tiếp tục gia tăng lên 1% và thời gian nuôi cấy kéo dài 72 giờ thì ức chế hoàn toàn vi khuẩn, kéo theo lượng EPS giảm nhiều. Điều này cũng được ghi nhận bởi Zhang et al. (2014) đã báo cáo Bacillus sp. có khả năng chịu mặn đến dưới 2% để cân bằng áp suất thẩm thấu, khi độ mặn vượt trên 2% thì chủng vi khuẩn Bacillus aerius NY6 sẽ duy trì sự sống bằng cách tạo bào tử. 

Bảng 2: Nhiệt độ, thời gian ủ và EPS của 3 dòng vi khuẩn Bacillus sp. BC1, BC2, BC3

Ghi chú: 3 lần lặp lại, ± độ lệch chuẩn với mức ý nghĩa p < 5%.

Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp EPS. 

Nhiệt độ đã ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp EPS (Bảng 2). Ở nhiệt độ 35oC, lượng EPS trung bình đạt 5,61 g/L. Khi nâng nhiệt lên 45oC thì lượng EPS giảm còn 4,23 g/L. Khi nhiệt độ tăng lên 60oC thì lượng EPS giảm 3,2 lần chỉ còn 1,73 g/L so với 35oC do khi nhiệt độ cao vượt ngưỡng chịu đựng thì vi khuẩn Bacillus sp. cần duy trì sự sống bằng cách tạo ra một số lượng lớn bào tử nhưng việc này lại hạn chế quá trình hình thành EPS. Dòng vi khuẩn BC1 Ở 35oC, sau 48 giờ nuôi cấy vi khuẩn BC1 đạt lượng EPS cao nhất đạt 9,05 g/L, lượng EPS thấp hơn ở 24 giờ và 72 giờ nuôi cấy, chỉ đạt 7,3 g/L và 7,15 g/L; điều này được ghi nhận tương tự bởi McKenney et al. Ở nhiệt độ ủ 600C, trong 24 h thu được 0,17 g thấp nhất trong các nghiệm thức. 

Kết luận

Thời gian nuôi cấy, nhiệt độ ủ và nồng độ muối NaCl đều ảnh hưởng trực tiếp khả năng tăng sinh khối và sản sinh ra EPS. Ở nồng độ muối 0,5%, nhiệt độ ủ 350C và thời gian nuôi cấy kéo dài 48 h sẽ là điều kiện tối ưu để thu được EPS nhiều nhất ở cả 3 dòng vi khuẩn Bacillus sp. Khi nồng độ muối, nhiệt độ ủ lên cao, thời gian nuôi cấy kéo dài thì lượng EPS tạo ra lại giảm đi rõ rệt. Dòng BC3 cho kết quả cao nhất với khối lượng exopolysaccharide là 11,25 g/L.

Tài liệu tham khảo

Angelin, J., & Kavitha, M. (2020). Exopolysaccharides from probiotic bacteria and their health potential. International Journal of Biological Macromolecules, 162, 853-865; 
Asgher, M., Urooj, Y., Qamar, S. A., & Khalid, N. (2020). Improved exopolysaccharide production from Bacillus licheniformis MS3: optimization and structural/functional characterization. International Journal of Biological Macromolecules, 151, 984-992; 
Kondo, T., & Iida, T. (1997). gamma-GCS and glutathione--new molecular targets in cancer treatment. Gan to Kagaku ryoho. Cancer & Chemotherapy, 24(15), 2219-2225;
McKenney, P. T., Driks, A., & Eichenberger, P. (2013). The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews Microbiology, 11(1), 33-44; 
Yeniel, N., Beyatli, Y., Aslim, B., & Yuksekdag, Z. N. (2006). Designated production of exopolysaccharide (EPS) and lactic acid with sugarbeet molasses by some lactic acid bacteria; 
Zaki, N. H. (2018). Biodegradable Plastic Production by Bacillus spp. Isolated from Agricultural Wastes and Genetic Determination of PHA Synthesis. Al-Mustansiriyah Journal of Science, 29(1), 67-74;
Zhang, X., Gao, J., Zhao, F., Zhao, Y., & Li, Z. (2014). Characterization of a salt-tolerant bacterium Bacillus sp. from a membrane bioreactor for saline wastewater treatment. Journal of Environmental sciences, 26(6), 1369-1374.

ĐOÀN THỊ MINH NGUYỆT, NGUYỄN KIM NGÂN, NGUYỄN TRẦN NHẪN TÁNH
Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
Nguồn: Tạp chí Tài nguyên và Môi trường số 11+12 năm 2024